Toona sinensis Extrakte zur Unterdrückung der Zellteilung und Absterben von Knochenkrebszellen,

[Archivar Patente]

Toona sinensis Extrakte

zur Unterdrückung der Zellteilung,

Absterben von Knochenkrebszellen


US Patent in dem verschiedene Toona sinensis Präparate beschrieben werden die zur Apoptose ( programmierter Zelltod , Suizidprogramm der Zelle ) oder zur Unterdückung des Zellwachstums bei Tumoren der Kochen eingesetzt werden können.

Toona sinensis , Cedrela sinensis, chin. Mahagoni oder chin. Toona ist ein weitverbreiteter Baum der Familie Meliaceae. Es können sämtliche Pflanzenbestandteile verwendet werden. I
In der Patentschrift werden u. a. wässrige Extrakte der Blätter von Toons sinesis aufbereitet. Die Präparate sollen gegen Knochenkrebs wirksam sein.


Link zum Patent:

Toona sinensis extract for suppressing proliferation and inducing apoptosis of osteosarcoma cells

US 20090169658 A1

[Pluspunkt]

Das Patent beschreibt einen Toona sinensis-Extrakt zur Unterdrückung der Proliferation und zur Induktion der Apoptose eines Osteosarkoms, jedoch nicht für normale menschliche Osteoplasten.
Das Extraktionsverfahren umfasst: Extrahieren von Toona sinensis mit Wasser, um einen ersten Extrakt zu erhalten, und Filtrieren des ersten Extrakts durch eine Membran, um ein Filtrat zu erhalten, und der erfindungsgemäße Toona Sinensis-Extrakt verursacht keine biologischen Schäden an normalen Knochenzellen. Darüber hinaus stellt die Erfindung weiterhin eine pharmazeutische Zusammensetzung bereit, die den Toona sinensis-Extrakt umfasst.

Laut Literatur haben Blätter des Toona sinensis-Baumes entzündungshemmende, antidotierende und wurmabtötende Wirkungen und sind zur Behandlung von Enteritis, Dysenterie, Karbunkeln, Furunkeln, Dermatitis rhus, Krätze und Tinea blanca sowie zur Verbesserung des Körpers nützlich Gesundheit. Darüber hinaus wurden wässrige Extrakte aus Blättern des Toona sinensis-Baums als Volksmedizin zur Verbesserung von Bluthochdruck und Diabetes verwendet.
Hseng-Kuang Hsu et al. fanden heraus, dass wässrige Extrakte der Toona sinensis-Blätter in der Lage sind, den Blutzucker bei Alloxan-induzierten diabetischen Ratten zu senken . In einer anderen Studie wurde festgestellt, dass wässrige Extrakte aus Blättern des Toona sinensis-Baums die Proliferation menschlicher Lungenadenokarzinomzellen unterdrücken können.

Kein Stand der Technik lehrt oder schlägt jedoch eine neue Verwendung für die Toona sinensis oder Extrakte vor, um das Wachstum von Osteosarkomzellen oder die Behandlung von Osteosarkomen zu unterdrücken. (Anmerkung: Diese Aussage ist notwendig um das Verfahren zu patentieren)

Die Erfindung stellt ein Verfahren zum Unterdrücken der Proliferation von Osteosarkomzellen bereit, umfassend das Verabreichen einer wirksamen Menge des Toona sinensis-Extrakts, wobei der Toona sinensis-Extrakt mit Wasser extrahiert wird.

Die Erfindung stellt ein Verfahren zum Unterdrücken der Proliferation von Osteosarkomzellen bereit, umfassend das Verabreichen einer wirksamen Menge des Toona sinensis-Extrakts, wobei der Toona sinensis-Extrakt durch die folgenden Schritte hergestellt wird: Extrahieren von Toona sinensis mit Wasser, um einen ersten Extrakt zu erhalten; Filtrieren des ersten Extrakts durch eine 30 bis 100 Mesh-Membran, um ein Filtrat zu erhalten; Zentrifugieren des ersten Extrakts, um einen Überstand zu erhalten, und Lyophilisieren des Überstands.
KURZE BESCHREIBUNG DER ZEICHNUNGEN
[0013]
Die vorliegende Erfindung kann durch Lesen der nachfolgenden detaillierten Beschreibung und Beispiele unter Bezugnahme auf die beigefügten Zeichnungen vollständiger verstanden werden, wobei:
[0014]
Figuren 1a-1b zeigen, dass der Toona-sinensis-Extrakt der Erfindung die Proliferation von U2-OS- und Saos-2-Zellen unterdrückt;
[0015]
Figuren 2a - 2b zeigen, dass der sterilisierte Extrakt von Toona sinensis eine bessere Unterdrückungseffizienz von Osteosarkomzellen aufweist als nichtfermentierter Extrakt;
[0016]
FEIGE. 3 zeigt, dass der Extrakt von Toona sinensis keine biologischen Schäden an normalen Knochenzellen verursacht;
[0017]
FEIGE. 4 zeigt, dass der Zellzyklus von Osteosarkomzellen nach der Behandlung des Toona sinensis-Extrakts in der G2-Phase angehalten wird;
[0018]
FEIGE. 5 zeigt, dass der Extrakt von Toona sinensis die Expression von p21-, p-cdc25C-RNA induziert, die Expression von cdc-2 und Cyclin-B1-RNA jedoch unterdrückt;
[0019]
FEIGE. Fig. 6 zeigt, dass der Toona sinensis-Extrakt der Erfindung die Expression von p21, p-cdc25C-Protein induziert, die Expression von cdc-2 und Cyclin B1-Protein in Osteosarkomzellen jedoch unterdrückt;
[0020]
FEIGE. 7 zeigt, dass der erfindungsgemäße Toona sinensis-Extrakt die Freisetzung von LDH (Lactat Dehydrogenase) in Osteosarkomzellen induziert;
[0021]
FEIGE. 8 zeigt, dass der Toona-sinensis-Extrakt der Erfindung die Apoptose von Osteosarkomzellen induziert;
[0022]
Figuren 9a - 9b zeigen, dass der Toona-sinensis-Extrakt der Erfindung die RNA-Expression des Bcl-2-Gens unterdrückt, aber die RNA-Expression des Bax-Gens induziert;
[0023]
Figuren 10a - 10b zeigen, dass der Toona sinensis-Extrakt der Erfindung die Proteinexpression des Bcl-2-Gens unterdrückt, aber die Proteinexpression des Bax-Gens induziert;
[0024]
FEIGE. 11 zeigt, dass das PARP-Protein durch den erfindungsgemäßen Toona sinensis-Extrakt von 116 kDa auf 85 kDa abgebaut wird; und
[0025]
FEIGE. 12 zeigt, dass der erfindungsgemäße Toona sinensis-Extrakt die Expression von Cyclophilin A-Proteinen in U2-OS-, Saos-2- und MG-63-Zellen erhöht.
DETAILLIERTE BESCHREIBUNG DER ERFINDUNG
[0026]
Die folgende Beschreibung betrifft die am besten in Betracht gezogene Art der Ausführung der Erfindung. Diese Beschreibung dient dem Zweck der Veranschaulichung der allgemeinen Prinzipien der Erfindung und sollte nicht als einschränkend verstanden werden. Der Umfang der Erfindung wird am besten durch Bezugnahme auf die beigefügten Ansprüche bestimmt.
[0027]
Die Erfindung stellt ein Verfahren zur Verhinderung der Proliferation und zur Induktion der Apoptose von Osteosarkomzellen bereit, umfassend die Verabreichung einer wirksamen Menge des Toona sinensis-Extrakts, wobei der Toona sinensis-Extrakt mit Wasser extrahiert wird.
[0028]
Der Toona sinensis-Extrakt der Erfindung kann aus den neuen Blättern oder zarten Knospen von Toona sinensis, vorzugsweise neuen Blättern, extrahiert werden.
[0029]
Das Extraktionsverfahren des Toona sinensis-Extrakts umfasst: (a) Extrahieren der Blätter des Toona sinensis mit Wasser durch Erwärmen, um einen ersten Extrakt zu erhalten; (b) Filtrieren des ersten Extrakts durch eine Membran, um ein Filtrat zu erhalten; (c) Zentrifugieren des ersten Extrakts, um einen Überstand zu erhalten; und (d) Lyophilisieren des Überstands, um den Toona sinensis-Extrakt zu erhalten.
[0030]
Zunächst wird den Blättern oder zarten Knospen der Toona sinensis eine geeignete Menge Wasser zugesetzt, zum Kochen erhitzt und gekocht. Dann werden die Blätter entfernt und mit einem 30-100 Mesh-Filtersieb, vorzugsweise einem 70 Mesh-Filtersieb, filtriert, um ein Filtrat zu erhalten. Das Filtrat wird 8 bis 15 Minuten bei 4 ° C bei 2000 bis 4000 Upm zentrifugiert, um einen Überstand zu erhalten.
[0031]
In einer Ausführungsform wird der Toona sinensis-Extrakt durch Stielsterilisation (Autoklavensterilisation) weiterverarbeitet. Der Zustand der Stielsterilisation kann 100 bis 130 ° C für 10 bis 20 Minuten, vorzugsweise 121 ° C für 15 Minuten betragen.
[0032]
In einer anderen Ausführungsform wird der Toona sinensis-Extrakt durch die folgenden Schritte weiterverarbeitet: Laden des Toona sinensis-Extrakts auf eine Flüssigkeitschromatographiesäule; Eluieren der Umkehrphasensäule mit einer Alkohollösung; und Sammeln des Alkoholeluats.
[0033]
In einer anderen Ausführungsform wird der Toona sinensis-Extrakt durch die folgenden Schritte weiterverarbeitet: Extrahieren des Toona sinensis-Extrakts mit einer Alkohollösung, um einen zweiten Extrakt zu erhalten; Zentrifugieren des ersten Extrakts, um einen Überstand zu erhalten, und Lyophilisieren des Überstands.
[0034]
Der erfindungsgemäße Alkohol schließt Methanol, Ethanol, Propylalkohol, Isopropanol, n-Butanol, Isobutanol oder eine Kombination davon ein, ist jedoch nicht darauf beschränkt.
[0035]
Der Toona sinensis-Extrakt der Erfindung kann die Proliferation von Krebszellen, vorzugsweise Osteosarkomzellen, wie U2-OS, MG-63 oder Saos-2 usw., wirksam hemmen. Der Toona Sinensis-Extrakt der Erfindung kann p21 induzieren. p35- oder p-cdc25-Proteinexpression und unterdrücken die cdc-2- oder Cyclin-B1-Proteinexpression in den Osteosarkomzellen, um den Zellzyklus von Osteosarkomzellen in der G2-Phase anzuhalten.
[0036]
Außerdem betrifft der erfindungsgemäße Toona-sinensis-Extrakt die Apoptose von Osteosarkomzellen. Der Toona-sinensis-Extrakt der Erfindung kann die Expression von Bax- und Cyclophilin A-Protein induzieren und die Expression von Bcl-2-Protein in den Osteosarkomzellen unterdrücken, um die Apoptose der Osteosarkomzellen zu induzieren
[0037]
Die Zusammensetzung der Erfindung verhindert und / oder behandelt Krebs, so dass die Zusammensetzung an Krebspatienten, Chemotherapiepatienten und Hochrisikogruppen-Krebspatienten usw. verabreicht werden kann. Außerdem ist die Zusammensetzung sehr sicher und verursacht keine biologischen Schäden dass die Zusammensetzung auch als Nahrungsergänzung dienen kann.
[0038]
Die Erfindung stellt ferner eine pharmazeutische Zusammensetzung zum Verhindern des Wachstums von Osteosarkomzellen bereit. Die Zusammensetzung der Erfindung umfasst eine wirksame Menge des Toona sinensis-Extrakts und einen pharmazeutisch akzeptablen Träger oder Hilfsstoff.
[0039]
Der Begriff "pharmazeutisch verträglicher Träger", wie er hier verwendet wird, bezieht sich auf Träger, die auf dem Fachgebiet als für die Herstellung von Pharmazeutika geeignet bekannt sind und Wasser, normale Salzlösung, Glycerin, organische Lösungsmittel, Stabilisatoren, Chelatbildner, Konservierungsmittel, einschließen, aber nicht darauf beschränkt sind. Emulgatoren, Suspendiermittel, Verdünnungsmittel, Gelbildner, Liposomen usw.
[0040]
Die pharmazeutische Zusammensetzung der vorliegenden Erfindung kann durch ein auf dem Fachgebiet bekanntes Verfahren zu Formen hergestellt werden, die für die parenterale, orale oder topische Verabreichung geeignet sind, einschließlich Injektion, Lösung, Kapsel, Dispersion, Suspension usw., ohne darauf beschränkt zu sein.
[0041]
Zur Herstellung einer oralen festen Zubereitung können ein Exzipient und, falls erforderlich, ein Bindemittel, ein Sprengmittel, ein Gleitmittel, ein Farbstoff, ein Geschmacksstoff und / oder dergleichen mit einem erfindungsgemäßen Extrakt gemischt werden. Die resultierende Mischung kann dann durch ein im Stand der Technik an sich bekanntes Verfahren zu Tabletten, Dragees, Granulaten, Pulver, Kapseln oder dergleichen geformt werden. Solche Additive können im allgemeinen auf dem vorliegenden Gebiet der Technik verwendet werden, einschließlich Hilfsstoffe: Lactose, Saccharose, Natriumchlorid, Glucose, Stärke, Calciumcarbonat, Kaolin, mikrokristalline Cellulose und Kieselsäure; Bindemittel: Wasser, Ethanol, Propanol, Saccharoselösung, Glucoselösung, Stärkelösung, Gelatinelösung, Carboxymethylcellulose, Hydroxypropylcellulose, Hydroxypropylstärke, Methylcellulose, Ethylcellulose, Schellack, Calciumphosphat und Polyvinylpyrrolidon; Sprengmittel: trockene Stärke, Natriumalginat, pulverisierter Agar, Natriumhydrogencarbonat, Calciumcarbonat, Natriumlaurylsulfat, Monoglycerolstearat und Laktose; Schmiermittel: gereinigter Talk, Stearatsalze, Borax und Polyethylenglykol; und Nebenwirkstoffe: Saccharose, Bitterorangenschale, Zitronensäure und Weinsäure.
[0042]
Um ein orales flüssiges Präparat herzustellen, kann ein Geschmacksstoff, ein Puffer, ein Stabilisator und dergleichen mit einem erfindungsgemäßen Extrakt gemischt werden. Die resultierende Mischung kann dann durch ein im Stand der Technik an sich bekanntes Verfahren zu einer Lösung zur inneren Verwendung, einem Sirup, einem Elixier oder dergleichen geformt werden. In diesem Fall kann der Geschmacksstoff der gleiche sein wie zuvor erwähnt. Der Puffer kann ein Natriumcitrat sein, während Beispiele für den Stabilisator Tragant, Gummi arabicum und Gelatine sind.
[0043]
Zur Herstellung einer Injektion können ein pH-Regler, ein Puffer, ein Stabilisator, eine Isotonizität und dergleichen mit einer erfindungsgemäßen Verbindung gemischt werden. Die resultierende Mischung kann dann durch ein im Stand der Technik an sich bekanntes Verfahren zu einer subkutanen, intramuskulären oder intravenösen Injektion geformt werden. Der pH-Regler und Puffer schließen Natriumcitrat, Natriumacetat und Natriumsulfat ein und sind nicht darauf beschränkt. Der Stabilisator umfasst Natriumpyrosulfit, EDTA, Thioglykolsäure und Thiomilchsäure. Die Isotonie umfasst Natriumchlorid und Glukose.
[0044]
Die Menge der Wirkstoffe, die mit den Trägermaterialien kombiniert werden können, um eine einzelne Dosierungsform herzustellen, hängt von der Person und der besonderen Verabreichungsart ab. Die erforderliche Dosierung variiert gemäß einer Anzahl von Faktoren, die dem Fachmann bekannt sind, einschließlich, aber nicht beschränkt auf die verwendete Verbindung oder Verbindungen, die Spezies des Subjekts, die Größe des Subjekts und die Schwere der damit verbundenen Erkrankung Bedingung, die Pruritus verursacht. Die Verbindungen können in einer einzelnen Dosis, in mehreren Dosen über einen Zeitraum von 24 Stunden oder durch kontinuierliche Infusion verabreicht werden. Wenn sie durch kontinuierliche Infusion verabreicht werden, können die Verbindungen durch im Stand der Technik wohlbekannte Verfahren bereitgestellt werden, beispielsweise durch intravenösen Schwerkrafttropfen, intravenöse Infusionspumpe, implantierbare Infusionspumpe oder beliebige topische Wege. Das Subjekt kann mit dem Extrakt der Toona sinensis einzeln oder in Kombination mit anderen Behandlungen wie Chemotherapie oder Strahlentherapie behandelt werden.
Beispiel Beispiel 1 Herstellung von Extrakten aus Blättern der Toona Sinensis

Beispiel 1 Herstellung von Extrakten aus Blättern der Toona Sinensis
[0045]
Zarte Blätter der Toona sinensis wurden gepflückt und lebhaft mit Wasser gewaschen. Eine geeignete Menge Wasser wurde zu den Blättern in einem Verhältnis von 4 Liter RO-Wasser zu 1 kg Blättern zugegeben. Die Mischung wurde zum Sieden erhitzt und gekocht. Dann wurden die Blätter entfernt und der Rest wurde langsam zu einem Konzentrat erhitzt, das mit einem Filtersieb (70 Mesh) filtriert wurde. Das filtrierte Konzentrat wurde unter Verwendung einer Virtis-Apparatur lyophilisiert, um einen Rohextrakt zu erhalten, der als "TSL-CE" bezeichnet wurde.
[0046]
Zusätzlich könnte das filtrierte Konzentrat vor der Lyophilisierung einer Zentrifugation unterzogen werden. Das filtrierte Konzentrat wurde 12 Minuten bei 4 ° C mit 3000 U / min (Beckman Avanti J-30I) zentrifugiert, um einen Überstand und einen Niederschlag mit unlöslichen Substanzen zu ergeben. Der Überstandsteil wurde einer Lyophilisierung unter Verwendung einer Virtis-Apparatur unterzogen, um einen lyophilisierten Wasserextrakt zu erhalten, der als "TSL-1" bezeichnet wurde.
[0047]
50 g Extrakt "TSL-1", der aus dem vorstehend genannten Extraktionsverfahren A erhalten wurde, wurde in 99,5% Ethanol gelöst, um eine Alkoholextraktion durchzuführen. Die so gebildete Alkohollösung wurde zentrifugiert, um einen Überstandsteil und einen Präzipitatteil zu ergeben. Der Überstandsteil wurde ferner einer Lyophilisierung unter Verwendung einer Virtis-Apparatur unterzogen, um einen weiter gereinigten Alkoholextrakt in Form eines lyophilisierten Pulvers zu erhalten, das als "TSL-2" bezeichnet wurde. Das TSL-2 wurde anschließend in verschiedenen Ethanolkonzentrationen gelöst (99,5% → 50% → 25% → 12,5%). Die so gebildete Ethanollösung wurde 12 Minuten bei 4 ° C und 3000 U / min zentrifugiert, um einen Überstandsteil und einen Präzipitatanteil zu ergeben. Der Überstandsteil wurde ferner einer Lyophilisierung unter Verwendung einer Virtis-Vorrichtung unterzogen, um einen Extrakt in Form eines lyophilisierten Pulvers zu erhalten, das als "TSL-3, TSL-4 und TSL-5" bezeichnet wurde. Das TSL-2 wurde anschließend in Wasser gelöst und zentrifugiert, um einen Überstand zu erhalten. Der Überstandsteil wurde weiter einer Lyophilisierung unterzogen, um einen Extrakt in Form eines lyophilisierten Pulvers zu erhalten, das als "TSL-6 und TSL-7" bezeichnet wurde. Die Zubereitungen von Extrakten aus Blättern der Toona sinensis sind in US-Pat. Nr. 7.229.652.

[Pluspunkt]

Das Patent beschreibt einen Toona sinensis-Extrakt zur Unterdrückung der Proliferation und zur Induktion der Apoptose eines Osteosarkoms, jedoch nicht für normale menschliche Osteoplasten.


Ansprüche (14)


1. Verfahren zur Unterdrückung der Proliferation von Osteosarkomzellen, umfassend das Verabreichen einer wirksamen Menge des Toona sinensis-Extrakts, wobei der Toona sinensis-Extrakt mit Wasser extrahiert wird.

Verfahren nach Anspruch 1, wobei der Toona-sinensis-Extrakt durch die folgenden Schritte hergestellt wird:
Extrahieren von Toona sinensis mit Wasser, um einen ersten Extrakt zu erhalten; und
Filtrieren des ersten Extrakts durch eine 30 bis 100 Mesh-Membran, um ein Filtrat zu erhalten.

Verfahren nach Anspruch 2, wobei der erste Extrakt durch die folgenden Schritte weiterverarbeitet wird:
Zentrifugieren des ersten Extrakts, um einen Überstand zu erhalten, und
Lyophilisieren des Überstands, um den Extrakt von Toona sinensis zu erhalten.

Verfahren nach Anspruch 3, wobei der Toona sinensis-Extrakt mit einem Dampfsterilisationsverfahren weiter behandelt wird.

Verfahren nach Anspruch 3, wobei der Toona-sinensis-Extrakt durch die folgenden Schritte weiterverarbeitet wird:
Laden des Toona sinensis-Extrakts auf eine Flüssigchromatographiesäule;
Eluieren der Flüssigchromatographiesäule mit einer Alkohollösung und
Sammeln des Alkoholeluats;

Verfahren nach Anspruch 3, wobei der Toona sinensis-Extrakt durch die folgenden Schritte weiterverarbeitet wird:
Extrahieren des Toona sinensis-Extrakts mit einer Alkohollösung, um einen zweiten Extrakt zu erhalten;
Zentrifugieren des zweiten Extrakts, um einen Überstand zu erhalten, und
lyophilisieren des Überstands.

Verfahren nach Anspruch 1, wobei der Toona sinensis-Extrakt aus den neuen Blättern oder zarten Knospen extrahiert wird.


Verfahren nach Anspruch 5, wobei der Alkohol Methanol, Ethanol, Propylalkohol, Isopropanol, n-Butanol, Isobutanol oder eine Kombination davon umfasst.

Verfahren nach Anspruch 6, wobei der Alkohol Methanol, Ethanol, Propylalkohol, Isopropanol, n-Butanol, Isobutanol oder eine Kombination davon umfasst.

Verfahren nach Anspruch 1, wobei der Toona-sinensis-Extrakt die Expression von p21, p53, p-cdc25 und Bax-Protein in Osteosarkomzellen induziert.

Verfahren nach Anspruch 1, wobei der Toona sinensis-Extrakt die Expression von cdc-2-, Cyclin-B1- und Bcl-2-Protein in Osteosarkomzellen unterdrückt.

Verfahren nach Anspruch 1, wobei der Toona sinensis-Extrakt die Apoptose von Osteosarkomzellen induziert.

14. Verfahren zur Unterdrückung der Proliferation von Osteosarkomzellen, umfassend das Verabreichen einer wirksamen Menge des Toona-sinensis-Extrakts, wobei der Toona-sinensis-Extrakt durch die folgenden Schritte hergestellt wird:
Extrahieren von Toona sinensis mit Wasser, um einen ersten Extrakt zu erhalten;
Filtrieren des ersten Extrakts durch eine 30 bis 100 Mesh-Membran, um ein Filtrat zu erhalten;
Zentrifugieren des ersten Extrakts, um einen Überstand zu erhalten, und
lyophilisieren des Überstands.

[Pluspunkt]

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Übersetzung: Google Übersetzer